霊芝菌糸体培養培地抽出物 (MAK) は、霊芝の菌糸体および培地を用いた健康食品であり、免疫活性化、細胞の保護、抗癌作用、ウイルス増殖抑制、アレルギー抑制など様々な効果がある。しかし、免疫抑制の緩和に対する効果については明らかになっていない。本研究では、AKの黒色腫メラノーマに対する抗腫瘍効果の検討およびメカニズム解析を行うことを目的とした。

【方法】
1.実験材料
MAKは、霊芝菌糸体をバガス（砂糖キビ搾汁残渣）と脱脂した米糠を含む混合固形培地に接種し、約3.5ヶ月間培養後、子実体発生直前に培地ごと粉砕し、熱水抽出・噴霧乾燥した粉末標品であり、野田食菌工業（株）から提供されたものを用いた。
2.胆癌マウスの作成
雌性のC57BL/6Jマウスの右足底球に、B16BL6メラノーマ細胞 (7.5 x 105 cells) を接種した。接種の24時間後より、MAK群には1%または2% MAK含有飼料を自由摂取させて飼育した。飼育期間中は、摂食量および腫瘍体積を測定した。腫瘍体積の計測は、イソフルラン麻酔下でマイクロノギスにて腫瘍の長径および短径を計測し、腫瘍体積 (mm3) =長径 x 短径2 /2の計算式から腫瘍体積を算出した。播種後21日目に血漿、脾臓、リンパ節および腫瘍組織を採取した。
3.免疫関連遺伝子の発現解析
担癌マウスより採取した脾臓および腫瘍からtotal RNAを抽出し、脾臓においてはIFN-γmRNA量、腫瘍においてはFoxp3およびTGF-β mRNA量をReal-time RT-PCR法により解析した。
4.膵臓細胞のペプチド刺激での腫瘍特異的T細胞の活性化による免疫関連遺伝子の発現解析
採取した脾臓を24 wellプレートで初代培養し、interleukin-2およびチロシナーゼ関連タンパク質 (H2Kb-binding) ペプチドまたはオボアルブミン (OVA) ペプチドで72時間刺激した。刺激後、細胞を回収し、 IFN-γ およびTGF-βmRNA量をReal-time RT-PCR法により解析した。